圖一：在19世紀末，恩斯特•阿貝（Ernst Abbe）對光學顯微鏡的分辨率限制做出了界定，認為大約是光波長的一半，即約為0.2微米。這意味著科學家們可以辨別完整細胞，以及其中一些被稱為細胞器的組成部分。然而，他們卻無法分辨一個正常大小的病毒或者單個蛋白質。
圖2：在常規(guī)光學顯微鏡中，可以區(qū)分線粒體的輪廓，但其分辨率卻無法超越0.2微米。
圖3：第一張由斯特凡•W•黑爾（Stefan W. Hell）使用STED顯微鏡拍攝而成的圖像。左邊為使用傳統(tǒng)顯微鏡拍攝的大腸桿菌，右邊是使用STED顯微鏡拍攝的同樣的大腸桿菌。STED圖像的分辨率是前者的3倍
圖4：單分子顯微鏡原理
圖5：中間圖像為溶酶體膜（lysosome membranes），是埃里克•白茲格（Eric Betzig）首次使用單分子顯微鏡拍攝的圖片之一。從中選取0.2微米的阿貝衍射極限大小顯示在右邊。左邊為用傳統(tǒng)顯微鏡拍攝的圖片，可以看出圖片分辨率提高了很多倍。 2014年度諾貝爾化學獎授予兩名美國科學家以及一名德國科學家，以表彰他們在“超高分辨率熒光顯微技術方面的貢獻”。來自美國 霍華德·休斯醫(yī)學研究所的埃里克·本茨格(Eric Betzig)，德國馬克斯普朗克 生物物理化學研究所的史蒂芬·赫爾(Stefan W. Hell)以及美國斯坦福大學的威廉·默爾納(William E. Moerner)共同分享了今年的化學獎。 光學顯微成像技術向納米尺度的邁進 血紅細胞，細菌，酵母菌以及游動的精子。當17世紀的科學家們第一次在光學顯微鏡下看到這些活生生的生物現(xiàn)象時，一個嶄新的世界在他們的眼前打開了。這就是光學顯微成像技術的誕生。自那以后，光學顯微鏡已經(jīng)成為生物學研究領域最重要的工具之一。其他顯微成像技術，如電子顯微鏡，都需要進行樣品的制備，而這樣的制備過程會殺死細胞。 借助分子發(fā)光技術超越物理極限 然而，長期以來，光學顯微成像技術的發(fā)展卻一直受制于一個物理極限值的約束。1873年，顯微技術專家Ernst Abbe提出了傳統(tǒng)顯微成像技術的物理極限值：這種技術的分辨率將永遠不能超過0.2微米。這一預言導致在20世紀的絕大多數(shù)時間里，科學家們都相信光學顯微成像技術將永遠無法讓他們突破到更細微的尺度上(Fig 1)。一些細胞內(nèi)部的細胞器，如為細胞活動提供能量的線粒體，它們的輪廓是可以看到的。但要想進一步觀察更小的對象，如細胞內(nèi)部單個分子之間的相互作用則是根本不可能做到的。這就有點像是觀察一座城市，你可以看到城市里林立的高樓，但卻無法看清其中生活的居民們進進出出的日常生活。為了了解細胞的日常運作，科學家們需要對單個分子的活動進行追蹤。 然而Abbe提出的這一物理極限由于今年的諾貝爾化學獎獲獎人的工作被突破了。從理論上說，現(xiàn)在再也沒有任何障礙，阻止科學家們對更小尺度上的物體進行觀察了。于是，顯微成像變成了納米顯微成像。 在突破Abbe極限的方案中，有兩種各自獨立發(fā)展出來的技術方法。而整個故事還得從1993年位于芬蘭西南部的一間學生宿舍里講起。有一天，當史蒂芬·赫爾在翻閱一本量子光學書時，他想到了一個絕妙的主意。 直面Abbe極限的年輕挑戰(zhàn)者 1990年在海德堡大學獲得博士學位之后，史蒂芬·赫爾一直在設想超越一個多世紀前提出的Abbe極限的方法。想要挑戰(zhàn)一種現(xiàn)存的主流觀點是令人興奮的。但當時德國的幾乎所有頂尖科學家都對他的想法持懷疑態(tài)度，于是赫爾轉而向遙遠的北方尋求支持。芬蘭圖爾庫大學一名主攻熒光顯微成像技術的教授給了他在自己研究組里的一個職位。赫爾堅信一定有著可以突破Abbe極限的方法。而當他在一本量子光學書中讀到有關受激發(fā)射的內(nèi)容時，一種全新的想法在他的腦海中逐漸成型。2009年時他曾經(jīng)這樣評價當時自己的感受：“當時，那個想法吸引了我。我終于有了明確的想要去追求的方向。” 解決方案：納米尺度的閃光樣品掃描 在芬蘭圖爾庫大學，赫爾專攻所謂熒光顯微成像學，這是一種技術方法，科學家們借助熒光分子對細胞的局部進行成像。比如說他們可以利用熒光抗體結合的方法來觀察分子DNA。他們利用短暫的閃光激發(fā)該抗體，讓它們在短時間內(nèi)發(fā)光。如果抗體與DNA結合了，那么它就會從細胞的核心部位發(fā)光，因為那里正是細胞核內(nèi)存儲DNA的位置。通過這種方法，科學家們可以判斷某一特定分子的所在位置。但這樣也僅僅是能讓科學家們確定大團分子，如纏繞糾纏的DNA分子的所在位置。這樣做的分辨率太低，難以區(qū)分出特定的DNA鏈。你可以想象一下看到纏繞的紗線，而看不清單根紗線的場景。 而當史蒂芬·赫爾讀到有關受激發(fā)射的內(nèi)容時，他意識到應當有可能制成一種裝置，其使用納米閃光燈掃過樣品，每次一納米。利用受激發(fā)射原理，科學家們可以冷卻熒光分子。它們將一束激光束對準一個分子，后者立即失去能量并變得暗淡。在1994年，史蒂芬·赫爾發(fā)表了一篇文章陳述了自己的這一想法。在這一他設想中的技術方案，也就是所謂“受激發(fā)射減損技術”(STED)中計劃采用閃光來激發(fā)所有的熒光分子，隨后利用另外一次閃光讓所有分子熒光熄滅——那些位于中部位置上納米尺度空間內(nèi)的除外(圖 2)。當進行記錄時則只記錄下這一部分。讓這一光束掃過整個樣品表面，并連續(xù)記錄光強信息，就有可能得到一張整體圖像。每次允許發(fā)出熒光的空間區(qū)域越小，最后得到的圖像分辨率便越高。于是，從原理上說，對于光學顯微成像的極限再也不復存在了。 在德國研制首臺納米閃光裝置 然而史蒂芬·赫爾的理論文章并沒有立即在學術界引起關注，但卻足以讓史蒂芬·赫爾在德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所獲得一個職位，在接下來的數(shù)年里，他將自己的設想逐漸變成現(xiàn)實：他開發(fā)出了STED顯微鏡。2000年，他證明了自己的技術方法在實際工作中是可行的。當時他對大腸桿菌進行了攝像，其分辨率是此前任何光學顯微鏡都從來未能達到過的(圖 3)。 STED顯微鏡通過多次小區(qū)域上采集光線并最終形成整體成像圖。與之相反，此次獲獎的第二種技術方案，即所謂“單分子顯微成像技術”，則涉及多幅整體圖像的疊加。埃里克·本茨格和威廉·默爾納各自獨立的奠定了這項技術的基礎。這一技術的最初故事是從默爾納首次成功探測到單個微小的熒光分子開始的。 默爾納——首次探測到單個熒光分子 在大多數(shù)化學方法中，比如測量熒光的吸收，科學家們一般都是同時對數(shù)以百萬計的分子同時進行觀察。這類實驗得到的結果一般代表的是典型或平均分子的情況。科學家們只能接受這樣的結果，因為這是無法改變的。但長期以來他們都一直夢想著有朝一日能夠對單一分子進行直接的測量，因為更加詳盡和豐富的認識或許能夠帶來對一些現(xiàn)象，比如疾病發(fā)展過程更深刻的理解。 于是，在1989年，當默爾納成為世界上首位成功測量單個熒光分子光吸收的科學家時，那是一項偉大的成就。當時他在IBM位于加州的研發(fā)中心工作。這項實驗開啟了通往新的未來的大門，并啟發(fā)大量化學家將他們的注意力轉向單分子研究，其中一位便是埃里克·本茨格。 8年之后，默爾納朝著單分子顯微成像技術又向前邁進了一步，他在此前曾經(jīng)被授予諾貝爾獎的綠色熒光蛋白技術(GFP)的基礎上進行了發(fā)展。 帶著開關的小燈泡 1997年，默爾納來到加州大學圣迭戈分校，后來被授予諾貝爾獎獲，GFP技術的發(fā)明人錢永佑教授也在這里任職。錢教授從水母體內(nèi)分離出發(fā)綠色熒光的蛋白，其重要意義在于它能夠讓活體生物體內(nèi)細胞的其他蛋白質同樣變得可見。運用基因技術，科學家們將這些綠色熒光蛋白與其他類型的蛋白進行耦合。這樣，利用綠色熒光作為標記，科學家們便能知道那些被標記的蛋白質在生物體內(nèi)所處的位置。 默爾納注意到GFP熒光分子的一種，其熒光可以被隨意的開啟或關閉。當他用波長488納米的光線激發(fā)這一蛋白質時，它開始發(fā)出熒光，但一會之后它就熄滅了。此后不管他再使用多少光線去照射它，這個蛋白質的熒光都已經(jīng)死了。然而，此后他發(fā)現(xiàn)，如果使用波長為405納米的光線去照射它，那么這個蛋白質又能再次復活并發(fā)出熒光。當該蛋白質被再次激活，它會再次發(fā)出波長為488納米的熒光。 默爾納將這些可以被激發(fā)的蛋白質融入一種溶膠，使其均勻散布其中，這樣其單個分子之間的距離就能大于當年Abbe衍射極限所限定的0.2微米的長度。由于這些分子被分散了開來，一臺常規(guī)的光學顯微鏡便可以區(qū)分來自單個分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著開關的微小燈泡。有關這一實驗的結果被發(fā)表在1997年的一期《自然》雜志上。 通過這一發(fā)現(xiàn)，默爾納顯示了通過光學手段操控單個分子熒光的可能性。這一結果解決了埃里克·本茨格兩年來一直困擾著他的問題。 厭倦了學術界，但仍對Abbe衍射極限感到著迷 與史蒂芬·赫爾一樣，埃里克·本茨格對于突破Abbe設下的衍射極限非常著迷。1990年代初，本茨格正在美國新澤西州貝爾實驗室開展一種名叫“近場光學顯微鏡”的研究工作。在近場光學顯微鏡中，光線是從極為貼近樣品表面，距離僅有幾個納米的薄片上發(fā)出的。這種顯微鏡可以突破Abbe的衍射極限，但這一方法也有著難以克服的缺陷。比如說，其產(chǎn)生的光線作用距離極短，因此難以呈現(xiàn)細胞表面以下的深處結構。 1995年，埃里克·本茨格得出結論，他認為近場光學顯微鏡已經(jīng)沒有多少進行進一步改進的空間。除此之外，他也感到自己并不適合學術界，因此決定結束自己的學術生涯。但他對自己接下來要去哪里感到迷茫。他從貝爾實驗室離職了，但有關Abbe衍射極限的問題仍然縈繞在他的腦海之中。在一個冬日的散步期間，他突然產(chǎn)生了一個新的念頭：是否有可能利用不同分子的不同特性來避開Abbe衍射極限的問題，比如利用那些能夠產(chǎn)生不同顏色熒光的分子？ 受到默爾納和其他科學家研究的啟發(fā)，埃里克·本茨格此前已經(jīng)利用近場光學顯微鏡觀察到了單分子的熒光現(xiàn)象。現(xiàn)在他開始思考這樣一個問題：如果不同的分子發(fā)出不同顏色的熒光，比如紅色，黃色和綠色，那么利用常規(guī)顯微鏡是否也有可能達成這樣高的分辨率？他的具體想法是讓顯微鏡每次只記錄一種顏色。如果所有發(fā)出同一種顏色的分子都散布開來，它們之間的間距都超過Abbe衍射極限所限定的0.2微米，那么這些單個分子的所謂位置便能夠被非常精確的確定下來。下一步，當不同顏色下記錄的圖像被疊加在一起，那么此時得到的圖像分辨率將會大大超越Abbe衍射極限所限定的水平，而紅色，黃色和綠色的分子即便它們各自之間的距離僅有幾個納米，此時將仍然可以被分辨出來。通過這種方法，Abbe的衍射極限問題就可以被繞開了。然而還存在一些實際問題，比如他找不到具有足夠可區(qū)分光學特性的分子。 1995年，埃里克·本茨格在《光學通報》雜志上報告了自己的理論設想，并在隨后離開了學術界并到他父親的公司工作去了。 重返學術界 有很多年時間，埃里克·本茨格與學術界完全脫離了。但有一天，渴望科學的種子再次在他身體里萌發(fā)了，于是他的目光再次回到了科學領域，這一次他注意到了關于綠色熒光分子的消息。他很快意識到這種可以讓活體細胞內(nèi)其他蛋白質發(fā)光的熒光蛋白質或許可以被用來繞開Abbe衍射極限。 真正的突破出現(xiàn)在2005年，這一年他無意間發(fā)現(xiàn)了一種可以隨意開啟或關閉其熒光的蛋白質，跟默爾納在1997年在但分子層面上所觀察到的情況很像。本茨格意識到這正是實施10多年前他頭腦中那個想法所缺少的工具。熒光分子并不一定需要具有不同的顏色，它們只要能在不同的時間發(fā)出熒光就可以了。 通過圖像疊加方法突破Abbe衍射極限 短短一年之后，埃里克·本茨格與其他研究激發(fā)熒光蛋白的科學家們一起，證明了他的技術方案在實踐中是可行的。在許多不同的實驗中，有一項實驗是將該蛋白質與溶酶體外膜結合，這里是細胞的回收站。在光信號刺激下，蛋白質發(fā)出熒光，但由于光線非常弱，只有一部分的蛋白質發(fā)光。由于數(shù)量少，幾乎每個分子之間的距離都要超過Abbe衍射極限所限定的0.2微米長度。于是，在顯微鏡下，每一個發(fā)光分子的位置都可以被非常精確的記錄下來。過了一會，等到這些分子的熒光逐漸熄滅之后，研究組再激活另外一組蛋白質分子，讓它們發(fā)出熒光。同樣的，只有一部分分子會發(fā)光，同樣的，記錄下每一次發(fā)光分子的圖像。這一過程被一再重復。 當本茨格最終將所有這些圖像疊加在一起時，他得到了溶酶體外膜結構的超高分辨率圖像。這張圖像的分辨率遠遠超出了Abbe衍射極限所限定的值。2006年，他們在《科學》雜志上發(fā)表了有關研究結果的論文，這是一項突破性的成就。 探索仍在繼續(xù) 這兩種分別由埃里克·本茨格，史蒂芬·赫爾以及威廉·默爾納發(fā)展出來的技術方法自那以后已經(jīng)導致多項納米尺度成像科技的誕生，目前已經(jīng)在世界各地得到廣泛應用。目前這三位獲獎人仍然活躍在這里研究領域的第一線，與越來越多投身這一研究領域的科學家們一道繼續(xù)開展工作。當他們將強大的納米成像設備對準組成生命的最微小組件，他們幫助人們獲得了大量最新的知識。史蒂芬·赫爾目前正致力于對神經(jīng)細胞的精密探查，以便更好加深對大腦突觸的理解；威廉·默爾納正在開展與亨廷頓綜合征有關蛋白質的研究，而埃里克·本茨格正在努力追蹤胚胎內(nèi)部細胞分裂的過程。這些都還只是他們正在從事的大量工作中的幾個案例。 但有一件事是可以肯定的，那就是2014年度的諾貝爾化學獎獲得者們已經(jīng)為我們奠定了堅實的基礎，去追尋人類最為重要的知識。 來源：新浪科技 |
