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1 引言 細菌總數檢測是食品衛生學檢測領域的重要檢測指標，主要是用來判斷食品被污染的程度。對細菌總數進行快速準確的檢測一直是該領域內重要的研究課題。對細菌總數進行檢測的國標方法是平板計數法，需要將樣品用營養瓊脂37℃培養48 h記數，測試時間長，操作繁瑣，不適合現場檢測。ATP生物發光檢測方法具有檢測速度快、成本低、易于操作等特點，已引起眾多研究者關注。同時，因為ATP生物發光技術以生物體內的ATP作為檢測對象，不僅包括細菌，也包括體細胞在內的食品殘渣等食品污染物，因此適合在食品衛生檢測領域對衛生狀況進行快速檢測。 使用ATP生物發光技術測量ATP最早見于1949年Mcelroy的報道。自此以后，ATP生物發光技術引起廣泛關注。本文在分析前人工作的基礎上，設計了一種ATP生物發光檢測儀，選擇光電倍增管(H5773-02，日本，濱松光子)作為光電轉換器件，其峰值響應波長為500 nm，與反應所發熒光波長基本一致，從而提高檢測靈敏度。本檢測儀采用自動加樣技術，在加入被檢測樣品后，在反應腔內由自動加樣裝置向檢測樣品池中自動加入反應試劑，從而既避免了外界光的干擾，也有效地提高了加樣精度，從而提高了儀表的檢測可靠性及準確性。利用本檢測儀對10-6～10-14mol／L標準ATP樣品進行了檢測，輸出信號與樣品濃度間的相關性達到0.986，可以滿足測量要求。 2 系統設計 2.1 檢測原理 ATP即三磷酸腺苷，是廣泛存在于生物體內的一種能量物質。實驗證明，在生理條件下，每個細菌細胞中所含ATP的含量大致相同，約為10-18mol／個。螢火蟲熒光素酶簡稱蟲光素酶，是一種能將化學能轉變為光能的活性蛋白質，即生物催化劑。ATP在蟲光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環境及二價鎂離子作用下，反應釋放出熒光。當熒光素及蟲光素酶過量情況下，釋放的熒光與ATP在一定范圍內成線性關系，因此可以通過測量熒光光強檢測樣品中的ATP，進而檢測其中的細菌總數。 2.2 結構設計 本檢測儀的結構如圖1所示，主要包括三部分，分別為自動進樣單元、光電轉換單元和信號采集處理及控制單元。其中，自動進樣單元包括三套蠕動泵(WX10，保定蘭格恒流泵有限公司)和試劑盒，分為獨立三路加樣通路，分別為體細胞裂解劑、細菌細胞裂解劑和熒光素一熒光素酶發光試劑。根據測試需要，蠕動泵在控制單元控制下，向光電轉換單元中的樣品池加入對應反應試劑。光電轉換單元包括檢測樣品池和光電轉換器件。為消除外界光的干擾，整個光電轉換單元被密封在暗盒中。光電轉換器件將反應釋放熒光轉化為電信號，由信號采集處理單元采集并處理，并對測試結果進行實時顯示和存儲。 2.3 電路設計 系統的電路結構如圖2所示。光電轉換器件將熒光信號轉換為電流信號，通過微處理芯片ADuC834(Analog Devices，美國)對信號進行采集及處理。ADuC834同時作為控制核心，控制自動加樣單元，顯示及存儲單元，并可將測量結果通過RS232接口上傳至上位機以進行結果分析。 2.4 軟件設計 檢測儀表的操作軟件由C語言編寫，軟件結構如圖3所示，共分三項功能模塊，分別為測量、記錄和儀表設置。其中，測量分為儀表獨立測量和連接電腦測量。儀表獨立測量時，微處理芯片ADuC834對一定時間內的信號采集并進行積分處理，然后將測試結果實時顯示，根據用戶選擇也可將測試結果上傳至計算機；聯機測量時，ADuC834對所采集的信號不進行處理，而是直接將其傳送到上位計算機中，并實時顯示時間響應曲線，方便用戶在計算機對所測數據進行分析，適合于實驗室中的測試分析。記錄子菜單分為記錄查詢和記錄刪除，用以對記錄進行操作。采用24LC256作為外部數據存儲芯片，本儀表設計可存儲測試結果200條，記錄查詢時可對逐條記錄進行顯示；記錄刪除則分為逐條刪除和全部刪除；設置子菜單可實現儀表校準和倍增管電壓調整兩項功能。 3 實驗與結果 3.1 器件選取 由于ATP生物發光所發光強較弱，因此本檢測儀選用高靈敏的光電倍增管作為光電轉換器件。利用F-4500熒光分光光度計(日本，日立)對ATP生物發光反應所發熒光波長進行掃描，峰值波長約為550 nm。為保證檢測具有更高靈敏度，所選光電倍增管的響應波長應與熒光波長一致。日本濱松光子的H5773-02型光電倍增管的響應波長為330～850 nm，峰值檢測波長在500～600 nm基本保持恒定，因此符合本系統設計要求。 3.2 結果與討論 實驗選擇標準ATP樣品作為檢測對象，濃度范圍為10-6～10-14mol／L，實驗中所用熒光素及熒光素酶購自美國普洛麥格公司。實驗采用聯機測量方式，將本檢測儀與計算機通過。RS232接口相連接，儀表信號采集單元采集熒光信號后直接上傳至計算機并將測試結果實時顯示。測量結果如圖4所示。 在反應中，加入發光反應試劑時，體系中樣品濃度相對較高，因此在短時間內即迅速反應釋放大量熒光，此時熒光光強較強，因此測量結果可能會超出系統的測試量程。由于本儀表的最大輸出電壓為2500 mV，反應初期釋放的熒光可能會超出該范圍，在圖中表現為前端的水平直線。隨著反應進行，體系中樣品和試劑的濃度逐漸降低，所釋放熒光隨之逐漸衰減。由圖可見，不同樣品濃度的ATP隨反應進行，進入測量量程的時間不同，濃度越高，衰減越慢，進入測量量程的時間越長，反之越短。對圖4中各響應曲線400 s內的測量值進行積分，作為各濃度樣品的輸出信號。輸出信號與濃度的關系如圖5所示。由圖可以看出，輸出信號隨濃度增加而增加，且有明顯梯度，兩者的線性相關系數達到0.986。這一結果說明本檢測系統可以對ATP濃度進行快速檢測。由于細菌細胞中所含ATP含量基本一致，因此，本檢測儀可實現對細菌總數的現場快速檢測。 4 結 論 本文針對細菌總數檢測需求，設計了一種基于ATP生物發光技術的細菌總數快速檢測儀。該檢測儀在對現有產品進行分析的基礎上，選擇H5773-02光電倍增管作為光電轉換器件，其檢測波長與生物發光反應所釋放熒光波長一致，可有效提高檢測靈敏度。采用自動加樣技術，在暗室內加入發光反應試劑，消除了外界光的干擾，且獲得了反應最初的信號。本文以細菌檢測的中間產物標準ATP溶液作為檢測對象，對所設計的檢測儀進行測試。將檢測儀與計算機連接測量，獲得了各反應所釋放熒光強度的時間響應曲線。在此基礎上，對響應曲線400 s內的值進行積分，作為對應樣品濃度的輸出信號，得到了輸出電壓與濃度的關系曲線，兩者的線性相關系數達到0.986，可滿足測試要求。本文所設計的針對細菌總數的檢測儀具有檢測速度快、自動化程度高、操作簡單、小型便攜等特點，在口岸、衛生監管部門、食品生產部門等對產品、環境等的衛生狀況進行現場快速檢測領域具有很好的應用前景。 |
